样品实验方案
简要概述
1.准备细胞
2.去除生长培养基
3.添加Fluo-8 NW染料工作溶液
4.在室温下孵育1小时
5.监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度
溶液配制
1.储存溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 Fluo-8 NW配制：
对于Cat No.36307，将10μLDMSO加入Fluo-8 NW（组分A）中，并充分混合。
对于Cat No.36308和36309，将100μLDMSO加入Fluo-8 NW（组分A）中，并充分混合。 注意：10μLFluo-8 NW原液足以容纳1个平板。
1.2分析缓冲液储备液（1X）：
对于Cat No.36307和36308，将9mL HHBS（组分C）加入10X Pluronic F127 Plus（1mL，组分B）中并充分混合。
对于Cat No.36309，将整瓶10XPluronic®F127Plus（10 mL，组分B）加入90 mL HHBS缓冲液（不包括在试剂盒中）中并充分混合。 注意：对于一个平板，10 mL的1X分析缓冲液就足够了。
2.工作溶液配制
将10μLFluo-8 NW DMSO储备溶液加入10mL 1X测定缓冲液中并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少2小时。
操作步骤
1.有关细胞样品制备的指南，请点击查看。
2.从细胞板上除去生长培养基。注意：重要的是去除生长培养基，以*大限度地减少背景荧光和化合物对血清或培养基的干扰。注意：或者，在含有0.5％至1％FBS的生长培养基中培养细胞，以避免培养基去除步骤。在这种情况下，需要在HHBS缓冲液中加入2X染料。 [我们为那些在生长培养基中使用0.5％至1％FBS以避免培养基去除步骤的人提供2个独立的无洗涤钙测定试剂盒（目录号36315和目录号36316）。
3.将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Fluo-8NW染料工作溶液加入到细胞板中。
4.将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。注意：如果测定需要37°C，立即进行实验，无需进一步室温孵育。注意：如果细胞在室温下运行时间较长，可在室温下孵育细胞培养板1-2小时（建议培养时间不超过2小时。）
5.用HHBS或所需缓冲液制备复合板。
6.通过监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度来进行钙通量测定。注意：在实验之前运行信号测试很重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到*大强度计数的10％至15％的水平。例如，FLIPR-384的*大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置以使其信号测试强度在7,000到10,000左右。
数据分析
从空白标准孔获得的读数（RFU（Max-Min））用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算卡巴胆碱剂量样品。
图1.使用Screen Quest Fluo-8 NW Assay Kit和Fluo-4 NW Assay Kit在HEK-293细胞中测量Carbachol剂量反应。 将HEK-293细胞以40,000个细胞/100μL/孔接种在Costar黑壁/透明底96孔板中过夜。 除去生长培养基，使用Screen Quest Fluo 8-NW钙测定试剂盒或Fluo-4 NW试剂盒（根据制造商的说明书）将细胞与100μL染料上样溶液一起在室温下孵育1小时 温度。 通过NOVOstar（BMG Labtech）添加卡巴胆碱（25μL/孔）以达到*终指示的浓度。 Fluo8 NW的EC50约为1.2μM。
|